Интервью и статьи

Г.А. Залецки, заведующая бактериологической лабораторией ГУ РЦГиЭ;

 Н.И. Гасан, врач-бактериолог ГУ РЦГиЭ.

Актуальность: Лабораторная диагностика острых кишечных инфекций является первостепенной задачей в процессе выявления этиологии заболеваний кишечника.

При идентификации патогенных и условно-патогенных энтеробактерий изучают их биохимическую активность и серологические свойства, поскольку они положены в основу их классификации и всегда используются для установления родовой принадлежности выделенных возбудителей, а также их видовой и типовой дифференциации. Идентификация энтеробактерий включает 3 этапа: а) первичную идентификацию; б) установление родовой принадлежности; в) идентификацию вида и внутривидовую дифференциацию.

Выполнение первого этапа предусматривает определение биохимических признаков изучаемой культуры с использованием сред для первичной идентификации (комбинированных сред), а при необходимости и тестов для дифференциации энтеробактерий от других грамотрицательных бактерий. На втором этапе применяют тесты минимального дифференцирующего ряда в наборе для установления рода (дифференциация от сходных родов). Третий этап идентификации предполагает использование дополнительных тестов для внутриродовой дифференциации -определение видов, биоваров и сероваров.

На втором и третьем этапах идентификации применяется общепринятый классический метод, при использовании которого на определение ферментативных свойств затрачивается 24-48 и более часов, расходуется много питательных сред и лабораторной посуды.

Для ускоренной диагностики изготовители бакпрепаратов выпускают различные тест-системы, которые позволяют сократить время выдачи результатов до 18-24 часов. В нашей бактериологической лаборатории                г. Тирасполь ГУ РЦГиЭ в 2020 году внедрены тест-системы для биохимической идентификации и дифференциации энтеробактерий  «ДС-ДИФ - ЭНТЕРО -12», изготовитель ООО «НПО» Россия, г. Нижний Новгород. Для установления родовой и видовой их принадлежности используется каталог, который включает в себя определение  54 видов значимых энтеробактерий, относящихся к 17 родам, по 12 биохимическим признакам.

Предлагаемый метод отличается высокой специфичностью, простотой

исполнения и высокой информативностью.

Материалы и методы. Метод основан на идентификацию до вида по двенадцати биохимическим признакам 24 штаммов микроорганизмов семейства энтеробактерий, выделенных в ходе бактериологического анализа. Для постановки биохимических рядов используются полистироловые микропланшеты 96- луночные разборные однократного применения, на дно лунок которых нанесены индикаторные питательные среды. Стерильный планшет с крышкой в герметической упаковке имеет 24 стрипа (по 12 лунок).

Набор тест-системы для идентификации энтеробактерий включает среды и                                                                                       реактивы, необходимые для учета 12 тестов. Эти тесты разбиты на 4 триады. Каждый тест  в триаде кодирован цифрой.

При учете биохимических реакций используются знаки «+» и «-» в зависимости от изменения цвета индикатора применяемых сред. Из суммы цифр со знаком «+» из каждой триады составлены коды для 54 видов энтеробактерий. Коды составлены для следующих родов энтеробактерий: Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Edwardsiella, Pantoea, Proteus, Providencia, Morganеlla, Yersinia, Kluyvera, Yokenella. Коды упорядочены по нумерации и сформированы в списки.

Ход исследования. Подлежащую изучению колонию со среды первичного посева для энтеробактерий (Эндо, Плоскирева) пересеваем на среды трехсахарный агар с мочевиной – Олькеницкого и питательный агар для выделения чистой культуры и учета биохимических свойств. Инкубируем при (37±0,5)°С 18-24 часа. Исследования проводим с чистой культурой, после определения принадлежности к семейству энтеробактерий (грамотрицательные палочки, оксидазоотрицательные, утилизирующие глюкозу, подвижные и неподвижные).

В день исследования стерильными пипетками вносим  в лунки одного ряда планшета ( стрипы) по 0,1 мл микробной суспензии одной культуры. В одном ряду лунок - среды для одной исследуемой культуры. Планшеты закрываем крышкой и помещаем в пакет. Инкубируем планшет при  температуре (37±0,5)°С 18-24 часа. Учет результатов биохимических реакций проводим по изменению цвета индикатора визуально в соответствии с цветовым показателем. При разложении или  при отсутствии разложения сред тестам ставим  знак «+» или «-». Биохимическую активность Klebsiella pneumoniae отражена в таблице № 2 с последующим определением ее кода:

                                                                                                        Таблица № 2.

Биохимическую активность микроорганизма Klebsiella pneumoniae

	цитрат натрия	сероводородд	В-галактозидаза	фенилаланин	лизин	орнитин	Лизин	маланат натрия	мочевина	сорбит	инозит	АМК
Кодовые цифры	4	2	1	4	2	1	4	2	1	4	2	1
Результат теста «+»или «-»	+	-	+	-	+	-	-	+	+	+	+	+
Сумма цифр со знаком «+» и код	5			2			3			7
Результат: наиме-нование культуры	Klebsiella pneumoniae

Окончательная идентификация условно-патогенных энтеробактерий проводится с помощью «кодов» по списку каталога. Дальнейшая идентификация энтеробактерий на серовары проводится с помощью серологических реакций.

Результаты и обсуждение. В 2020 году с июля  по сентябрь одновременно двумя методами биохимической идентификации (ускоренным - в планшетах и классическим - в пробирках) было выполнено 50 исследований. В ходе данных исследований идентифицированны следующие представители семейства энтеробактерий которые отражены в таблице № 3 и диаграмме 1:

                                                                                                       Таблица № 3

Выделенные микроорганизмы по системе «ДС-ДИФ - ЭНТЕРО -12»

с	Количество штаммов 2020 г	Процентное соотношение микроорганизмов
Патогенные энтеробактерии
Salmonella muenchen	14	28 %
Salmonella enteritidis	8	16 %
Salmonella coeln	1	2 %
Условно-патогенные энтеробактерии
Klebsiella pneumoniae	7	14 %
Klebsiella oxytoca	6	12 %
Escherichia coli	10	20 %
Enterobacter cloacae	1	2 %
Serratia marcescens	2	4 %
Citrobacter freundii	1	2 %

 

 

Диаграмма 1

Учет проводился по «коду» и по таблице биохимической идентификации. Конечные результаты во всех 50 случаях идентичны. Ускоренный метод исследования с применением каталога для установления родовой и видовой принадлежности энтеробактерий равнозначен по результатам классическому методу идентификации энтеробактерий.

При постановке каждого биохимического ряда тест - на газообразование глюкозы - учитывали на среде Олькеницкого, а для теста на  подвижность использовали 0,3 % полужидкий питательный агар. Для остальных 12-ти тестов были использованы - при ускоренном методе стандартные среды в планшетах завода-изготовителя, в которые вносили по 0,1 мл микробной суспензии одной культуры на 1 лунку планшета, а при классическом методе -  по 5,0 мл сред в пробирках, приготовленных в лаборатории. Таким образом, при ускоренном методе идентификации расходуется в 7 раз меньше жидких питательных сред         и  используются микропланшеты, на  которых можно одновременно поставить 24 биохимических ряда и требуется меньше лабораторной посуды и затрат труда.

Предлагаемый микролуночный метод ускоренной биохимической идентификации энтеробактерий позволяет сократить сроки выдачи результатов на 18 часов.

        Выводы:

1. Тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий и учет результатов по каталогу “кодов” равнозначен по достоверности классическому методу.
2. Предложенный способ является более экономичным, поскольку сокращает расход питательных сред, химических реактивов и лабораторной посуды и затраты труда.
3. Уменьшает трудоемкость исследований.
4. Метод позволяет сократить сроки выдачи результатов на 18 часов.

Литература:

1. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. - Тирасполь: М3 и СЗ Г1МР, 2003.
2. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред. Акад. РАМН В.И. Покровского. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - 768 с.: ил. - (XXI век).
3. Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология. - Москва, Academia, 2003.